胡爱红^1,2    陈丽芝¹   史宝军¹   王卫卫²

（1.广东溢多利生物科技股份有限公司  珠海  519060; 2.西北大学生命科学学院  西安  710069）

摘要   采用DNS法对基因工程菌毕赤酵母所产的木聚糖酶在最适反应pH、最适反应温度、金属离子的影响等酶学性质以及采用TLC 和HPLC法对该酶的酶解产物进行了研究，结果表明：该木聚糖酶的最适pH值为4.5，在pH3.5－6.0范围稳定；最适反应温度为55℃，耐热稳定性良好；Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺对木聚糖酶活性有不同程度的促进作用；Cu²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺等对木聚糖酶有一定的抑制作用。TLC、HPLC测定结果显示：木聚糖酶酶解产物主要以木二糖、木四糖等低聚糖为主，而木糖含量很低；该木聚糖酶是相对单一的内切木聚糖酶。

关键词：木聚糖酶，酶学性质，底物降解

Studies on the properties of xylanase expressed in Pichia pastoris

Hu Ai-hong   Che Li-zhi  Shi Bao-jun  Wang Wei-wei

(1.GUANGDONG VTR BIO-TECH CO.LTD. ZHUHAI 519060; 2.COLLEGE OF LIFE SCIENCES,NWU.XIAN 710069)

Abstract   Enzymatic properties of Xylanase from Bioengineered Pichia pastoris were studied on the optimal temperature and pH , effect of metal ionic  by DNS method and its reaction products with TLC and HPLC method. The results showed that the xylanase had an acidic optimum pH of 4.5, and it was stable over pH range from 3.5 to 6.0. The optimal reaction temperature of xylanase was 55℃. The divalent metal ions of Mg²⁺、Zn²⁺ and Ca²⁺could enhance the activity of xylanase, whereas Cu²⁺、Ba²⁺ and Fe³⁺ inhibitedited the activity. Reaction products obtained from enzymatic hydrolysis mainly contained xylobiose and xylotetraose, which proved that it was the single endo-xylanase.

Key word:  Xylanase; enzymatic properties; substrate hydrolysis

木聚糖酶可广泛应用于饲料、烘烤、保健饮料、生物转化、医药、造纸、能源、纺织等行业^[1,2]。在工业化应用中，特别是在饲料和造纸方面，木聚糖酶耐热、耐碱、热稳定性好且无(低)纤维素酶活是理想特征^[3-5]。在自然界中有多种微生物可降解、利用木聚糖、例如真菌、细菌等^[6~8]，为了掌握常用饲用酶制剂中木聚糖酶的酶学性质，本试验通过对一种自产的基因工程菌毕赤酵母发酵所得的木聚糖酶的酶学性质的研究，进行了热稳定性、最适pH值、最适反应温度、不同金属离子对其酶活的影响等等，最终通过TLC、HPLC测定，分析了该木聚糖酶的酶解产物。

1.      材料与方法

1.1  实验材料

木聚糖酶：广东溢多利生物科技股份有限公司采用毕赤酵母发酵生产；木糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖：Sigma公司；3，5-二硝基水杨酸（DNS）：国药集团化学试剂有限公司；硅胶薄层层析板：青岛海洋化工厂等。

1.2木聚糖酶活力的测定

木聚糖酶的测定采用DNS法^[9]。木聚糖酶在一定条件（pH4.5，55℃）下，催化水解底物木聚糖生成木糖等还原糖，还原糖又同DNS试剂发生显色反应，用分光光度计测定其色度，计算酶活力。酶活力单位定义：在一定条件下，每mL待测酶液每min催化1.0%底物生成1umol木糖的量为一个酶活力单位（U）。

1.2.1木聚糖酶的性质研究

（1）木聚糖酶的最适温度

  pH4.5下，取等量液体酶液，分别在30~80℃水浴条件下进行酶解反应，按1.2的方法测定酶活。以酶活力最高者为100%。

（2）木聚糖酶的最适pH

在60 ℃下，分别用pH值1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制1%木聚糖溶液，测定酶活力。以酶活力最高者为100%。

（3）金属离子等对木聚糖酶活力的影响

分别配制Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Na⁺、Fe²⁺、Fe^{3+ +}、K⁺、Co²⁺及EDTA终浓度为0.001mol/L无机盐的木聚糖溶液，测定酶活力。以不加任何无机盐的木聚糖溶液作为底物,测出的酶活力为100%。

（4）木聚糖酶的耐热性实验

取等量酶液在其最适反应温度60℃下保温不同时间，在其最适反应条件下测定其剩余酶活。以不保温的酶活力作为100%。

（5）木聚糖酶对pH的稳定性

将等量酶液分别与pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的缓冲液混合，在37℃水浴保温酶液4hr然后放入冰水浴冷却，按1.2的方法测定酶活，以酶活力最高为100%。

1.2.2 酶解反应及其产物分析

（1）酶解反应

在500mL的三角瓶中加入150mL木聚糖含量为1.0％的酶解底物和一定量的木聚糖酶，在pH4.5，55℃，60rpm的条件下反应一定时间。分别于不同时间取样，取样后立即置于沸水浴中5min使酶失活，冷却后离心，取上清液测定还原糖（g/L）和可溶性总糖（g/L）。

（2）可溶性总糖测定

取一定量的样品3000r/min离心15min，取上清液加入H₂SO₄，使H₂SO₄质量分数达6.5％，100℃下反应2h，20％NaOH中和反应液，过滤，滤液采用DNS法测定还原糖。

（3）平均聚合度(DP)

    木聚糖经酶水解后,其分子被降解,导致还原糖量上升,同时水溶性增加。用平均聚合度（DP）来衡量木聚糖被水解的程度，其数值越接近1.0，表示水解越彻底。

平均聚合度(DP)=可溶性总糖量（g/L）／还原糖量（g/L）

（4） 酶解产物薄层层析(TLC)

硅胶板于展层剂中上行展层3次（每次吹干后进行下一次展层），喷显色剂后，于105℃烘箱中放置5分钟，进行显色。

（5）酶解产物的HPLC分析

色谱柱：Waters Sugarpak, 6.5mm×300mm；流动相：脱气超纯水；检测器灵酸敏度：4；柱温：85℃；流速：0.4ml/min；进样体积：5μL；检测器：示差折光检测器 waters2410；样品经0.22um微孔膜过滤后直接进样。

2、结果与分析

2.1酶作用的最适条件

2.1.1酶作用的最适温度

从图1可以看出该酶的最适温度为55℃左右，合适的反应温度为45-60℃，温度低于30℃或高于70℃时酶的相对活力均很低，80℃时相对酶活仅为9.3%。

2.1.2酶作用的最适pH

结果见图2。实验结果表明，酶反应的最适pH值为4.5，在pH3.5 ~ 6.0 范围内, 酶活性维持在80%以上，pH<2.5和pH>7.0，酶活力下降较快。

2.1.3金属化合物对木聚糖酶活的影响

通常饲料中需要添加各种阳离子，以满足动物生长的需要。约有1/3的酶催化活性也需要金属离子，其活力受到金属离子的影响，可被激活或抑制。因此金属离子是激活剂还是抑制剂，要视酶的种类而定。本文考察了pH4.5时几种常见影响酶活力的金属离子以及EDTA对木聚糖酶活性的影响。

结果表明：Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺对木聚糖酶活性有不同程度的促进作用；Cu²⁺、Na²⁺、Fe²⁺等对木聚糖酶有一定的抑制作用；Fe^{3+ +}、K⁺、Co²⁺等对木聚糖酶的活性没有明显的作用；EDTA对酶活力没有明显的影响，这说明木聚糖酶反应基本不需要金属离子的参与。

2.2 酶的稳定性

2.2.1 酶的热稳定性

    应用于饲料工业的酶制剂产品，其耐热性是一项重要的指标。根据方法所述测定不同温度及时间内的木聚糖的耐热性能，结果如图4所示，该木聚糖酶在55℃相当稳定，在该温度下处理60min，酶活几乎没有损失，处理120min后酶活仍高达90%以上；而经60℃、70℃的热处理，酶活下降较快，但60℃经120min、70℃经100min处理后酶活仍有50%以上。

2.2.2 酶的pH稳定性

      按照方法所述，将木聚糖酶在不同pH条件下处理4h，结果如图5。

在pH3.5-7.0的范围内，酶活性相当稳定，残余酶活保持在80%以上，说明此酶具有较宽的pH值适应性，最适反应pH值为4.5。该特性与动物胃肠道环境类似，为其在畜牧业上的应用奠定了基础。

2.3 木聚糖酶对不同来源的木聚糖底物的降解作用

2.3.1平均聚合度（DP）的变化

由表1、2可以看出，酶解反应初期（20min），产物的平均聚合度（DP）迅速下降，DP值为2.127、2.037，酶解液中还原糖浓度也快速提高到3.003g/L、3.899g/L。这显示所采用的木聚糖酶具有很高的内切型木聚糖酶活力，可快速切断主链β-1,4-木糖苷键，生成短链低聚物；酶解40min后，产物的平均聚合度变化趋缓，这可能是由于产物低聚木糖对木聚糖酶的反馈抑制作用增强所致，同时也显示出所用的木聚糖酶制剂中缺乏木二糖酶。

2.3.2TLC结果表明，随着反应时间的增加，燕麦、桦木木聚糖逐渐被木聚糖酶降解生成一系列寡糖。整个反应过程，体系中二糖及二糖以上相对含量较高；反应至3h，体系中仍有一定量的较大分子寡糖或低聚糖存在。降解产物中未检出木糖，这说明该木聚糖酶主要是内切型木聚糖酶，不含或仅有少量木糖苷酶。

2.3.3HPLC结果及分析

从HPLC测定结果可以知道，木聚糖酶酶解产物主要以木二糖、木四糖、木五糖为主，另外还产有少量的木三糖，而木糖含量很低。说明：是相对单一的内切木聚糖酶，不含β-木糖苷酶等外切木聚糖酶（或酶活较低）。

参考文献

[1]Neeta K, Abhay S, Mala R. Molecular and biotechnological aspects of  xylanases[J].FEMS Microbiology Reviews，1999，23:411-456.

[2]焉永亮.Thermoascus aurantiacus木聚糖酶的生产及应用研究[D].杭州:浙江大学.2003

[3] 刘超纲，勇强，余世袁.低(无)纤维素酶活的木聚糖酶制备途径与潜在用[J].纤维素科学与应用，2001.9(2):1-7.

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