胡爱红，陈琼银，史宝军

（广东溢多利生物科技股份有限公司，广东珠海 519060）

摘要：为提高木聚糖酶在毕赤酵母工程菌中的表达量，优化了工程菌发酵的种龄、接种量、诱导时间、诱导浓度、pH值等条件。结果表明：种龄16h，接种量4%，生长pH 4.8，诱导pH 5.0，甲醇浓度1%，诱导时间96 h时，摇瓶发酵酶活力大于4550 u/ml。

关键词：毕赤酵母；木聚糖酶；优化
中图分类号：     文献标志码：A     文章编号：1001-8255
Optimization of Fermentation Conditions for Expression of Xylanase in Recombinant P. pastoris
HU-Aihong, CHEN-Qiongying, SHI-Baojun
(Guangdong VTR Bio-tech Co.Ltd., Zhuhai 519060)

ABSTRACT: The fermentation conditions including species age, inoculum volume, induction time, induction of concentration, and pH value were optimized for the enhancement of the expression of xylanase in recombinant P.pastoris. The results showed that the better conditions were species age of 16h, inoculum of 4%, the growth of pH 4.8, induction of pH 5.0, methanol concentration of 1%, induction time of 96 h. Under these conditions, the enzymatic activity could reach to 4 550 u/ml.

Key Words: Pichia pastoris; xylanase; optimization

     半纤维素是含量仅次于纤维素的可利用自然资源，主要成分是木聚糖。木聚糖酶（xylanase）以内切方式作用于β-l,4-糖苷键，将木聚糖水解为木二糖和木二糖以上的低聚木糖^[1]及少量木糖和阿拉伯糖，在制浆造纸、食品、饲料等行业应用广泛^[2-3]。自然界中有多种微生物^[4-5]可降解、利用木聚糖，本研究考察从国外引进的毕赤酵母基因工程菌摇瓶发酵制备的最佳条件。

1.       仪器与材料

1.1 仪器

卧式恒温培养摇床：镇江东方生物工程设备。
净化工作台：苏州净化设备有限公司。
pH电极：上海精密科学仪器有限公司。
台式离心机TDL80-2B型：上海安亭科学仪器厂。

1.2试药

Yeast extract和Peptone：购自Oxoid公司。
YNB：购自Invitrogen公司。
木糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖：Sigma公司。
生物素(D-Biotin)：浙江新和成股份有限公司。 
其他试剂均为国产分析纯。

1.3菌种

重组毕赤酵母基因工程菌YDL2006(Mut^s)，国外引进（本公司实验室保藏）。

1.4培养基

种子平板培养基（%）：Yeast extract 10g/L，Peptone 20g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L。
种子培养基（%）：Yeast extract 10g/L，Peptone 20g/L，葡萄糖20 g/L。
BMGY培养基（%）：YNB13.4g/L，葡萄糖5g/L，生物素0.4mg/L ,0.1mol/LpH6.0的磷酸缓冲溶液100ml/L，酵母粉 10g/L, 胰蛋白胨20g/L。
BMMY培养基（%）：YNB13.4g/L，甲醇5ml/L，生物素0.4mg/L ,0.1mol/LpH6.0的磷酸缓冲溶液100ml/L，酵母粉 10g/L, 胰蛋白胨20g/L。
PTM1溶液：  五水硫酸铜CuSO₄.5H₂O 6.0g/L，氯化钻0.5g/L，碘化钠0.08g/L，氯化锌20.0g/L，一水硫酸锰3.0g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，钼酸钠0.2g/L，生物素0.2g/L，硼酸0.02g/L，硫酸5ml/L。

2 方法与结果

2.1酶活力测定方法

参照DNS法^[8]。酶活定义：在一定条件（pH4.5，55℃）下，催化水解底物木聚糖生成木糖等还原糖，还原糖又同DNS试剂发生显色反应，用分光光度计测定其色度，计算酶活力。酶活力单位定义：在一定条件下，每ml待测酶液每min催化1.0%底物生成1umol木糖的量为一个酶活力单位（u）。
D600：发酵液混匀后，取lmL发酵液稀释至OD600=0.1-0.3(d=1cm)，于波长600nm处以去离子水为对照进行比色测定，D600=读数×稀释倍数。

2.2摇瓶培养

将保藏的菌种接种于种子平板上，30℃培养72h，挑取新鲜单菌落到含有100ml种子培养基的500ml带挡板的三角烧瓶中，30℃培养36h，作为种子摇瓶。将种子液2ml接种于50mlBMGY的250ml带挡板的三角烧瓶中，30℃振荡（220r/min）培养24h，D₆₀₀大于30，将50mlBMGY菌液离心（相对离心力2325×g），弃去上清液，以BMMY培养基50ml悬浮在相同规格的三角烧瓶中继续于30℃振荡（220r/min）培养5d，每24h补加一定量甲醇诱导产物的表达，按“2.1”项下方法测定木聚糖酶的活力。

2.3摇瓶生长曲线的绘制

在YPD培养基中，以0.5%接种量接种，种子摇瓶过程中每隔3h测定生物量，得到菌体生长曲线图，见图1。

图1  菌种YDL2006 的生长曲线

从图中可知：该菌种大约0-9h为生长延滞期；9-18h为对数生长期；18-24h为平衡期；24h后为衰亡期；本研究选择培养16h的菌种转入BMGY发酵摇瓶培养，以确保菌种在旺盛时期充分利用营养物质生长代谢。

2.4 种龄的影响

在种子培养基中，以0.5%接种量接种，分别培养14h、16h、18h、20h、22h，再按4%接种量转接50mlBMGY摇瓶培养24h,离心弃上清，按“2.2”项下方法转至50ml BMMY培养基中培养，之后每24h加入终浓度为1%的甲醇，检测其生物量及酶活，结果见表1，以种龄为16h时最终发酵液的菌体量最大，酶活力最高，因此YDL2006工程菌的种龄以16h为最佳。

2.5  接种量的影响

用种龄为16h的菌种，分别以1%、2%、3%、4%、5%的接种量转接到50mlBMGY摇瓶培养24h,离心弃上清，换50mlBMMY培养基培养，之后每24h加入终浓度为1%的甲醇，检测其生物量及酶活。结果见表1。发酵的菌体浓度随接种量的增加而增加，但酶活以4%接种量为最高，高于或低于4%酶活均减少，故最佳接种量为4%。

2.6 诱导时间的影响

用种龄为16h的菌种，4%接种量转接到50mlBMGY摇瓶培养24h,离心弃上清，换50ml BMMY培养基培养，之后每24h加入终浓度为1%的甲醇，以诱导24-120h进行摇瓶发酵后，检测其生物量及酶活力。结果见表1。甲醇慢速利用型酵母细胞在以甲醇为唯一碳源和能源的诱导培养基中生长时，前期利用甲醇很慢，甚至出现菌体自溶，表现为菌体湿重略有下降。中后期则以细胞维持生长和表达外源蛋白为主。随着培养时间的增加，细胞密度和酶活也逐步增加。当诱导培养到96h，表达量最高；诱导培养120h后，表达量有所下降,可能是由于菌体自溶或蛋白质降解的缘故。

2.7 甲醇浓度对酶活的影响

以0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%的不同甲醇诱导浓度按“2.2”项下方法培养，结果见表1。 甲醇浓度对工程菌细胞的生长和表达都有影响，甲醇浓度过高对细胞有毒害作用，抑制菌体生长和蛋白的生成，并加速已生成蛋白的降解，所以甲醇浓度有一定的上限阈值，过低浓度会使细胞持续饥饿，生物量和表达量都下降，维持适当的甲醇浓度是保证高表达量的关键，该菌种最佳的甲醇诱导浓度为1.0%。

2.8  pH值的影响

2.8.1初始pH值对菌体生长的影响

在250ml三角瓶中分别装入50ml的不同pH值(4.6、4.8、5 .0、5 .2、5 .4) BMGY，以16h的种龄、4%接种量接入，培养24h,离心弃上清，观察菌体的生长情况，由此选择合适的pH值生长培养基。结果见表1。重组菌在pH 4.8生长状况最好，同时观察了不同起始pH下木聚糖酶的酶活，当生长阶段pH为4.8时，酶活力最高。该菌种以pH 4.8的BMGY为菌体生长培养基。

2.8.2诱导pH值对酶活的影响

生长培养基BMGY的pH值不变，培养24h,离心弃上清，换至在250ml三角瓶中不同pH值(4.6、4.8、5 .0、5 .2、5 .4)的BMMY培养，每24h加入终浓度为1%的甲醇，诱导96h，检测其生物量及酶活。结果见表1。该菌种的诱导pH为5.0时，酶活力最高；当低于pH4.4时，可能对于菌体生长和产酶都不利，所以菌体浓度和酶活均低；当pH高于5时，酶活下降较快，可能高pH不利于木聚糖酶的分泌表达。因此最适合的诱导pH为5.0。

                                                               表1  各种因素对酶活的影响

2.9  正交实验

通过4因素3水平的正交实验确定摇瓶中毕赤酵母产酶的最佳培养条件。正交设计及实验结果见表2。

表2  正交设计表

通过正交实验结果分析，各因素影响毕赤酵母表达木聚糖酶的主次顺序为D＞C＞B＞A，最佳条件组合为A₂B₃C₂D₂，即转接量为2：1，诱导pH5.0，诱导时间96h，甲醇浓度1%，以此组合进行实验，三次重复，得到结果4551u/ml，比引进菌种时的发酵单位4330u/ml提高了近5%。

3 讨论

 巴斯德毕赤酵母表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。目前国内外对木聚糖酶在毕赤酵母的表达方面做了大量研究，如Aspergillus nige,Streptomyces olivaceovirdis等来源的木聚糖酶在毕赤酵母中得到成功表达^[6-7]。