生物工程室    胡爱红

发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。

一、染菌的危害：

1、 产生菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；
2、 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比产生菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；
3、 杂菌会污染最终产品，如生产单细胞蛋白时，从发酵液中分离出的细胞夹杂有杂菌；
4、 杂菌所产生的物质，使目的产物的提取发生困难；
5、杂菌降解了所需要的产物；
6、发酵时如污染噬菌体，可使产生菌发生溶菌现象。

二、染菌的检查与判断：

1、 显微镜检查：通常用革兰氏染色法。先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。
2、平板划线培养或斜面培养检查法。
3、肉汤培养检查法：此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
    此外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、pH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。

三、染菌的分析：

1、种子带菌。原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。
2、无菌空气带菌。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
3、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。
4、设备渗漏引起染菌。发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。
5、操作失误和技术管理不善也会引起染菌。如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。

四、染菌的预防：

无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。在发酵前期或中期染菌，杂菌会很快消耗营养物质，使生产菌无法正常生产而引起倒罐。在发酵后期染菌，一般亦会使产率下降并影响产物的提取。我们可以通过一下几个步骤进行预防：

㈠ 空气净化方面：

1  吸入空气前处理设备  

因为高空空气尘埃少且微生物含量远低于地平面，故空气压缩机吸气口(采风塔)通常以离地面5～10米为宜，如为减少噬菌体出现机会，吸气口更应离地面15～20米为好.吸入的空气在进入压缩机前应先通过粗过滤器过滤，减少进入空气压缩机的灰尘和微生物的数量，以减少机械杂质造成压缩机的磨损，并减轻后空气除菌介质的除菌负荷。常用的粗过滤器介质有涤纶无纺布或中孔聚氯酯泡沫塑料。粗过滤器可作成板式或袋式。吸气口流速小于lOm／s，粗过滤器气流速度一般为2～2.5m³／m².min为宜。

2  选用合适空压机

发酵生产中要求提供大量的无菌压缩空气供发酵通气用。工厂常采用往复式，螺杆式、涡轮式空气压缩机作为空压站的主要设备。发酵生产用压缩机一般以排气压力0.2～0.3Mpa低压居多.往复式空压机的价格比较低廉，操作与维修比较方便，单位比功率较小.但其出口流量因受往复压缩之故很不稳定，有脉冲现象，而且活塞与汽缸往复摩擦必须有润滑装置，使压出空气中夹带大量油雾给压缩空气的除菌带来一定困难。为了解决这一缺点，目前有些工厂采用由二硫化钼的氟塑料制成的活塞环代替原来的金属环作无油润滑，效果甚好，既有利于后面的空气净化除菌，又节约了润滑油，但由于氟塑料的弹性不及金属环，故气缸中气体泄漏虽增加，改装后的空气压缩机的排气量一般要减少lO％左右。中型空气压缩机可采用转子表面喷涂自润滑耐磨材料的螺杆压缩机，其体积较小，噪音，振动低。大型空气压缩机较多采用涡轮式压缩机，与往复式空气压缩机相比，具有体．积小，重量轻，占地小，运转平稳、供气置大，出口压力稳定、输出的压缩空气不含油雾等优点。   

3  压缩空气后处理设备合理配备及“热过滤”

 经过空压机压缩后的空气具有较高的温度，冷却后又具有较高相对湿度，并可能析出水滴，此外经油润滑的往复式空压机压缩的空气还带有一定量油雾，这些都给空气除菌带来许多不利因素。为此，必须把压缩机出口的空气加以适当的预处理:进行必要的降温、减湿和除油．一般压缩后空气温度120～130℃左右经一级冷却至40～45℃，二级冷却至20～25℃，再加热至35～40℃进入总空气过滤器除菌处理。用作空气冷却器的设备一般为管壳式(列管式)换热器，也有采用板翅式换热器的。列管式换热器传热系数较坻，仅60～120w／m.k左右。如采用新型的板翅式换热器，传热系数最大可达350w／m.k。加热器亦可采用列管式和套管式二种。列管式体积小，传热效率较高。除水，除油在冷却器和贮罐处进行外，一般采用旋风分离器及照网除沫器。经多年生产实践，列管式空气一级，二级冷却器、加热器传热面积配置可分别按1Nm／min空气量0.5m³。 “热过滤”即压缩后空气不经强制冷却而直接过滤除菌的一种节能方法。压缩后高温空气经自然冷却，控制温度50～60℃，保持在露点以上，直接过滤。此尝试曾初步获得成功，取得较好节能效果，并能省去大量冷却、加热设备。一般情况下处理lONm／rain压缩后空气需17kw冷量，排放冷凝水0．5kg／h。

4  除尽压缩空气中的杂菌

除去空气中的杂菌，只要把空气温度冷却到5℃以下就行了。因为在高温季节(夏天)，空气中湿度大。因此杂菌活跃，且数量多，将这种环境下的空气吸入压缩机，虽然进入压缩机后，空气温度可以升至150℃以上，杀死很多杂菌。但由于时间很短，不可能全部杀死，所以仍有部分杂菌活着通过。后虽经棉花过滤器等几级过滤，仍不可能100%滤去。另外，就是100％滤去也只能是刚开始的短暂时间里，时间一长，细菌在棉花等过滤器中也将逐步积累、增多，必将由少量杂菌进入发酵罐，使发酵罐内染菌，时间越长，过滤器积累越多，最后通过过滤器进入发酵罐的染菌必定越多，继而造成发酵染菌严重的恶果。

温度越低，单位空气中水蒸汽含量也越低，当空气温度为30℃时，每公斤干空气(约0.78 m。)含水蒸汽为27克，当温度降至5℃时，每公斤干空气含水蒸汽为5.2克。由此可见降低空气温度是可以降低空气中的水份,进而起到除杂菌作用! 因为在生产中，将压缩室气进行冷却。空气湿含量也越少，多余的水蒸汽必然冷凝成水，而沉入底部被放出。空气中的细菌都是内眼看不见的微小生物。水蒸汽向杂菌凝聚变为雨滴而沉入底部进而被排去达到了除杂菌的效果。如果我们将空气温度降至5℃，这时每公斤干空气，也尚有5.2克的水蒸汽。但由于细菌起到“雨种”作用，而优先成雨下沉被除去，达到基本除去杂菌目的。若仍有个别未除去，但经后面棉花过滤器等多级处理也就差不多了。

㈡设备方面：

1 发酵罐的灭菌 ：

发酵罐是生物工业生产最重要的设备，也称之为生物反应器。对其灭菌过程如下： 

a．反应器进行气密实验后，通入饱和蒸汽；  

b．打开放空阀排净空气，现代化的发酵罐放空阀上还连有过滤器防止内外环境不会污染；   

c．当罐内压力上升到0．1MPa即121℃时，对罐内和罐上连接的阀门进行灭菌；   

d．当达到工艺灭菌要求后，关闭蒸汽阀同时打开无菌空气进口阀进行保压。

2．管路的灭菌   

种子罐和发酵罐上连接的管路如接种管、空气管、流加管、进出料管和取样管等在使用前必须分段进行灭菌。于是，在管路系统的设计中就应该考虑如何满足灭菌要求和尽量减少死角，并确保在灭菌之后保持无菌状态。凡管路需要分段灭菌的，则在管路上安装一个带有辫子的阀门，物料管则选用便于清洗和灭菌的隔膜阀门。当然，为了便于设备及管道的清洗、蒸汽杀菌，对设备的制造，材料的选用，管道的安装及焊缝光洁度也需严格要求。

五、染菌后的挽救：

根据染菌时间的不同，分以下几种情况处理：

1、种子培养期染菌

此时期染菌的特点是生产菌少，防御杂菌能力低，容易污染杂菌。染菌后的处理措施是全部废弃培养液。

2、发酵前期染菌

因为发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。所以发酵前期最易染菌，且危害最大。

染菌补救措施，由于培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。

3、发酵中期染菌

在此时期染菌对发酵影响较大，可以干扰产生菌的代谢，改变发酵液环境。

主要补救措施有：降温培养、减少补料、提前放罐等

4、发酵后期染菌

在发酵后期，因已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力，所以对发酵影响较小。

主要补救措施有：染菌不多的情况下，对生产影响不大，可以按照正常放罐。如果染菌严重，破坏性较大，可提前放罐。